Cnvkit Copy Number

何时使用

当你需要从 BAM 文件检测**体细胞拷贝数变异（CNV）**时使用本条，典型场景：

• 从肿瘤-正常配对的 WES / 靶向 panel 测序 call 体细胞 CNV
• 仅有肿瘤样本（tumor-only）时，用 pooled normal 或 flat 参照检测拷贝数改变
• WGS 数据用 --method wgs 跑全基因组均匀 bin
• 估计未知样本的肿瘤纯度（purity）与倍性（ploidy），以解读拷贝比
• 为 GISTIC2 / cBioPortal / IGV 生成 SEG 文件
• 识别 focal 扩增（ERBB2、MYC、EGFR…）或纯合缺失（CDKN2A、RB1…）

不该用本条的边界：

• 带大型配对正常 panel（PoN）的深度 WGS 队列 → 用 GATK CNV（gatk DenoiseReadCounts / ModelSegments）更合适
• 需要等位基因频率 / B-allele fraction 建模 → 用 Control-FREEC
• CNVkit 的优势在靶向/外显子（antitarget off-target bin 价值大），不是深度 WGS

步骤

1. 准备：sorted+indexed BAM（肿瘤±配对正常）、capture target BED、参照基因组 FASTA、R+DNAcopy（CBS 需要）
2. 建参照（reference）：配对正常 / flat / pooled 三选一，校正 GC、可比对性，设中性基线
3. 测深：target/antitarget 切 bin，coverage 算 target 与 antitarget 每 bin 深度
4. 归一：fix 对参照归一化（GC、文库深度、捕获效率），产出 .cnr
5. 分段：segment 用 CBS（需 R DNAcopy）或 HMM（无需 R、更快），产出 .cns
6. call 状态：call 赋整数 CN，分类扩增/缺失，可带 --purity/--ploidy
7. 可视化：scatter / diagram / heatmap
8. 估纯度倍性：call --purity auto --method clonal
9. 导出：export vcf|seg|bed 供下游工具

指令

安装前先查环境是否已有（pixi/conda 内常见）：command -v cnvkit.py，有则跳过；pixi 项目内用 pixi run cnvkit.py。

# 安装（推荐 conda，自动处理 R/DNAcopy 依赖）
conda install -c bioconda cnvkit
cnvkit.py version                     # cnvkit 0.9.10
# CBS 分段需 R DNAcopy：
Rscript -e 'if(!requireNamespace("BiocManager")) install.packages("BiocManager"); BiocManager::install("DNAcopy")'
samtools index tumor.bam; samtools index normal.bam

一键配对分析（WES，hybrid 法）：

cnvkit.py batch tumor.bam --normal normal.bam \
    --targets targets.bed --fasta GRCh38.fa \
    --output-dir cnvkit_results/ --diagram --scatter --method hybrid
# 产出：.targetcoverage.cnn/.antitargetcoverage.cnn/.cnr/.cns/-scatter.png/-diagram.pdf

关键参数：

示例

分步流水线（pooled 参照 → 归一 → 分段 → call）：

# 建 pooled normal 参照（最稳健）
cnvkit.py batch normal1.bam normal2.bam normal3.bam --normal \
    --targets targets.bed --fasta GRCh38.fa \
    --output-reference pooled_reference.cnn --output-dir normals_cov/

# 切 bin + 测深
cnvkit.py target targets.bed --annotate refFlat.txt --split -o targets.split.bed
cnvkit.py antitarget targets.bed --access access-5k-mappable.hg38.bed -o antitargets.bed
cnvkit.py coverage tumor.bam targets.split.bed -o tumor.targetcoverage.cnn
cnvkit.py coverage tumor.bam antitargets.bed   -o tumor.antitargetcoverage.cnn

# 归一 → 分段 → call
cnvkit.py fix tumor.targetcoverage.cnn tumor.antitargetcoverage.cnn pooled_reference.cnn -o tumor.cnr
cnvkit.py segment tumor.cnr -o tumor.cns --method cbs       # 或 --method hmm（无需 R）
cnvkit.py call tumor.cns --purity 0.7 --ploidy 2 -o tumor.call.cns

# 可视化 + 导出
cnvkit.py scatter tumor.cnr -s tumor.cns -o tumor-scatter.png
cnvkit.py diagram tumor.cnr -s tumor.cns -o tumor-diagram.pdf
cnvkit.py export seg tumor.call.cns -o tumor.seg            # GISTIC2/cBioPortal
cnvkit.py export vcf tumor.call.cns -o tumor.cnv.vcf

tumor-only（无配对正常，用 flat 参照）：

cnvkit.py reference --targets targets.bed --fasta GRCh38.fa --output flat_reference.cnn
cnvkit.py batch tumor.bam --reference flat_reference.cnn --output-dir tumor_only_results/

WGS 模式（无需 capture BED，全基因组均匀 bin）：

cnvkit.py batch tumor_wgs.bam --normal normal_wgs.bam --method wgs \
    --fasta GRCh38.fa --output-dir wgs_results/ --scatter

Python API（cnvlib）解析 .cnr/.cns 并按 log2 分类癌基因 CNV：

import cnvlib
cns = cnvlib.read("tumor.call.cns"); df = cns.data
# log2 阈值（二倍体）：>=1.0 AMP / >=0.2 GAIN / <=-1.0 LOSS / <=-3.5 HOMDEL
def classify(x):
    if x >= 1.0: return "AMP"
    if x >= 0.2: return "GAIN"
    if x <= -3.5: return "HOMDEL"
    if x <= -1.0: return "LOSS"
    return "NEUTRAL"
df["cnv_class"] = df["log2"].apply(classify)
amps = df[(df["cnv_class"]=="AMP") &
          df["gene"].str.split(",").apply(lambda g: any(x in onco for x in g))]
print(df["cnv_class"].value_counts(), amps[["chromosome","gene","log2","cn"]])

估纯度倍性：cnvkit.py call tumor.cns --purity auto --ploidy 2 --method clonal --center median -o tumor.call.auto.cns。

注意事项

• 染色体命名一致：BAM、BED、FASTA 的 1 vs chr1 必须统一，否则结果错乱。
• antitarget 高噪声（off-target <0.1× 均深）：加大 --antitarget-avg-size 到 500kb，分段前加 --drop-low-coverage。
• CBS 报 Error in DNAcopy：R DNAcopy 未装/不兼容 → BiocManager::install("DNAcopy")，或改 --method hmm（无需 R）。
• 所有段都接近 0（测不到 CNV）：可能纯度过低（<20%）或覆盖太浅 → 用 --purity auto 验证，查 target 深度。
• GC 波浪偏差：用配对正常 BAM 重建参照，并确保 reference 带 --fasta 做 GC 校正。
• 过度分段（碎段多）：加 --threshold 0.2 或 --smooth-cbs 降低假边界。
• 覆盖要求：WES 建议 target 均深 ≥50×，WGS 20–30× 即可。
• purity 校正：call --purity 把 log2 比按掺入正常细胞回算到绝对 CN，纯度未知时优先 auto。
• ImportError: cnvlib：激活正确 conda 环境后再跑（conda activate cnvkit_env）。

互见

• related：genomic-file-toolkit —— BAM/BED/VCF/FASTA 等基因组文件的检查与转换
• related：single-cell-rnaseq-analysis、gene-set-enrichment-analysis、scientific-database-lookup
• combines_with：nextflow-pipeline-builder —— 把 CNVkit batch 编排进多样本队列流水线
• combines_with：guided-statistical-analysis —— 对 SEG/段级 CNV 表做下游统计与可视化

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