Fastp Fastq Preprocessing

何时使用

当 Agent 需要在比对（STAR/BWA-MEM2/Salmon）之前对 Illumina 原始测序数据做一站式质控与接头修剪时使用本条，典型场景：

• 任何 NGS 流程（RNA-seq、WGS、WES、ChIP-seq、ATAC-seq）比对前去接头、去低质量碱基。
• 作为流程第一步，逐样本产出 HTML+JSON 质控报告，再交 MultiQC 汇总。
• 双端数据优先用重叠（overlap）自动识别接头，而非手动指定接头序列。
• 3′ 端富集 RNA-seq（QuantSeq、Smart-seq）去 polyA/polyX 尾。
• 按 UMI 或 index 拆分 FASTQ 用于解多路复用（demultiplexing）。

不该用本条的边界：

• 已比对/已变异的文件（BAM/CRAM/VCF）解析、覆盖度统计 → 用 genomic-file-toolkit。
• 需要 FastQC 那种逐碱基质量详细图随修剪一并产出 → 用 Trim Galore。
• 需要细粒度滑动窗口（sliding-window）裁剪步骤的精细控制 → 用 Trimmomatic。

fastp 比 Trim Galore / Trimmomatic 快 3–10×，单遍多线程，效果相当或更好，已是上述流程的标准预处理工具。

步骤

1. 检查与安装：先 command -v fastp，已在 pixi/conda 环境则跳过安装；pixi 项目里用 pixi run fastp。
2. 准备输入：单端或双端原始 FASTQ（.fastq / .fastq.gz）。
3. 单端：自动识别接头跑修剪（见示例）。
4. 双端：加 --detect_adapter_for_pe 启用重叠自动识别 + --correction 校正重叠区错配。
5. 调质量/长度阈值：按场景设 --qualified_quality_phred 与 --length_required（变异检测从严，普通流程从宽）。
6. RNA-seq 3′ 富集协议：加 --trim_poly_x --poly_x_min_len 10 去 polyA 尾。
7. 解析 JSON 做自动质量门禁（quality gate），批量时再用 MultiQC 汇总所有报告。

指令

关键参数（默认值 → 效果）：

安装与校验：

command -v fastp || conda install -c bioconda fastp   # 已有则跳过
# 或预编译二进制（Linux）
wget https://github.com/OpenGene/fastp/releases/download/v0.24.0/fastp
chmod +x fastp
fastp --version    # fastp 0.24.0

接头自动识别失败时显式指定（Illumina TruSeq）：

fastp -i R1.fq.gz -I R2.fq.gz \
  --adapter_sequence AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA \
  --adapter_sequence_r2 AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT \
  -o R1.out.fq.gz -O R2.out.fq.gz

示例

双端：重叠法自动识别接头 + 校正（推荐默认）：

fastp \
    -i sample_R1.fastq.gz -I sample_R2.fastq.gz \
    -o sample_R1.trimmed.fastq.gz -O sample_R2.trimmed.fastq.gz \
    -h sample_qc.html -j sample_qc.json \
    --thread 8 \
    --correction --detect_adapter_for_pe \
    --qualified_quality_phred 20 --length_required 36

单端（自动识别接头）：

fastp -i sample.fastq.gz -o sample.trimmed.fastq.gz \
    -h sample_qc.html -j sample_qc.json \
    --thread 8 --qualified_quality_phred 20 --length_required 36

变异检测的从严过滤：

fastp -i R1.fastq.gz -I R2.fastq.gz \
    -o R1.filtered.fastq.gz -O R2.filtered.fastq.gz \
    -h qc.html -j qc.json --thread 8 \
    --qualified_quality_phred 25 --unqualified_percent_limit 20 \
    --length_required 50 --max_len1 150 --max_len2 150 \
    --low_complexity_filter --complexity_threshold 30

RNA-seq 去 polyA 尾（QuantSeq 3′ mRNA-seq）：

fastp -i quantseq_R1.fastq.gz -o quantseq_R1.trimmed.fastq.gz \
    -h quantseq_qc.html -j quantseq_qc.json --thread 8 \
    --trim_poly_x --poly_x_min_len 10 \
    --qualified_quality_phred 20 --length_required 25

解析 JSON 做质量门禁（自动卡通过率）：

import json

def parse_fastp_json(path: str) -> dict:
    with open(path) as f:
        d = json.load(f)
    before, after = d["summary"]["before_filtering"], d["summary"]["after_filtering"]
    return {
        "reads_in":   before["total_reads"],
        "reads_out":  after["total_reads"],
        "pct_passed": after["total_reads"] / before["total_reads"] * 100,
        "q30_after":  after["q30_rate"] * 100,
        "adapter_trimmed": d["filtering_result"]["adapter_trimmed"],
    }

m = parse_fastp_json("sample_qc.json")
if m["pct_passed"] < 70:        # 通过率 <70% 报警
    print("WARNING: 通过率偏低，检查原始数据质量")

批量预处理 + 汇总（多样本循环 → MultiQC）：

SAMPLES=(ctrl_1 ctrl_2 treat_1 treat_2); DATA=data; OUT=trimmed; QC=qc/fastp
mkdir -p "$OUT" "$QC"
for s in "${SAMPLES[@]}"; do
  fastp -i "$DATA/${s}_R1.fastq.gz" -I "$DATA/${s}_R2.fastq.gz" \
        -o "$OUT/${s}_R1.fastq.gz" -O "$OUT/${s}_R2.fastq.gz" \
        -h "$QC/${s}.html" -j "$QC/${s}.json" --thread 8 \
        --correction --detect_adapter_for_pe \
        --qualified_quality_phred 20 --length_required 36
done
multiqc qc/fastp/ -o qc/ -n fastp_multiqc_report   # 汇总所有 JSON

Snakemake 规则（嵌入流程）：

rule fastp_pe:
    input:  r1="data/{sample}_R1.fastq.gz", r2="data/{sample}_R2.fastq.gz"
    output: r1="trimmed/{sample}_R1.fastq.gz", r2="trimmed/{sample}_R2.fastq.gz",
            html="qc/{sample}_fastp.html", json="qc/{sample}_fastp.json"
    threads: 8
    shell:
        "fastp -i {input.r1} -I {input.r2} -o {output.r1} -O {output.r2} "
        "-h {output.html} -j {output.json} --thread {threads} "
        "--correction --detect_adapter_for_pe "
        "--qualified_quality_phred 20 --length_required 36"

注意事项

• 单端不要用 --detect_adapter_for_pe：它依赖双端重叠，单端识别不到接头时改为显式 --adapter_sequence AGATCGGAAGAGC。
• 接头含量异常高（>50%）：多为短插入文库（small RNA / miRNA）或建库差，核对文库协议，可用 --overlap_len_require 10 调重叠灵敏度。
• 过滤掉太多读（通过率 <60%）：阈值过严或测序质量差，放宽 --qualified_quality_phred 到 15、--length_required 降到 25。
• JSON 缺字段 / MultiQC 解析不到：旧版 fastp 升级（conda update fastp）；MultiQC 要 multiqc qc/ 而非 multiqc .，确认 qc/*.json 存在。
• 输出 FASTQ 为空：阈值过极端或输入有误，先 zcat sample.fq.gz | head -8 验证输入，去掉 --low_complexity_filter 重试。
• polyA 没去掉：必须显式加 --trim_poly_x --poly_x_min_len 10，仅 3′ 富集协议需要。
• 大文件慢：提高 --thread 到 8–12，输入放 SSD 等快速存储。
• 关键产物：*.trimmed.fastq.gz（修剪后读）、*.html（交互质控报告）、*.json（机读指标，供自动化/MultiQC）、stderr 日志（过滤统计）。

互见

• genomic-file-toolkit：fastp 产出的 fastq.gz 比对成 BAM 后，做区域抓取/覆盖度/变异解析时。
• nextflow-pipeline-builder / single-cell-rnaseq-analysis：把 fastp 作为预处理步嵌入 Nextflow 流程或上游接 scRNA-seq 分析时。
• gene-set-enrichment-analysis：下游 RNA-seq 定量后做富集分析时。

本条采编自 jaechang-hits/SciAgent-Skills（CC-BY-4.0），适配重写而非逐字翻译。