Single Cell Rnaseq Analysis

何时使用

当你需要对单细胞 RNA-seq 数据做标准探索性分析时使用本条，典型场景：

• 分析 .h5ad、10X Genomics、CSV 格式的 scRNA-seq 数据
• 质控（QC）过滤低质量细胞/基因、双胞（doublet）检测
• PCA / UMAP / t-SNE 降维与可视化
• Leiden 聚类、寻找 cluster marker 基因、注释细胞类型
• 轨迹推断 / 拟时序（PAGA、扩散拟时）
• 生成发表级单细胞图表

不该用本条的边界：

• 需要深度学习 / 概率生成模型、批次校正建模 → 用 scvi-tools
• 仅有 AnnData 数据结构与 I/O 问题 → 用 anndata 相关资料
• 跨条件/样本的严谨差异表达：不要把 rank_genes_groups 的每细胞 p 值当作严谨 DE（细胞非独立观测会膨胀 p 值），应先 pseudobulk 聚合再用 pydeseq2

步骤

1. 安装与配置环境（Python 3.12+，anndata ≥0.10）
2. 读入数据并理解 AnnData 结构
3. 质控：计算 QC 指标、可视化、按阈值过滤、（可选）双胞检测
4. 归一化与预处理：normalize_total → log1p → 备份 raw → 选高变基因 HVG → 回归混杂 → scale
5. 降维：PCA → 邻接图 neighbors → UMAP（或 t-SNE）
6. 聚类：Leiden（多分辨率试探）
7. Marker 基因：rank_genes_groups（仅探索性）
8. 细胞类型注释：marker 可视化 + cluster→类型映射
9. 保存结果与导出元数据

指令

环境（当前稳定版 scanpy 1.12.x，2026-01）：

uv pip install "scanpy[leiden]"        # [leiden] 装 python-igraph + leidenalg
# 可复现：uv pip install "scanpy[leiden]==1.12.1"
# 大数据/out-of-core 可加 dask（实验性）：uv pip install "scanpy[leiden]" dask

初始化（推荐用 settings 存图，逐图 save= 在 1.12 已弃用）：

import scanpy as sc, pandas as pd, numpy as np
sc.settings.verbosity = 3
sc.settings.set_figure_params(dpi=80, facecolor='white')
sc.settings.figdir = './figures/'
sc.settings.autosave = True

读入：sc.read_10x_mtx(...) / sc.read_10x_h5(...) / sc.read_h5ad(...) / sc.read_csv(...)。 AnnData 关键字段：adata.X（细胞×基因表达）、.obs（细胞元数据）、.var（基因元数据）、.obsm（PCA/UMAP）、.raw（原始备份）、.obs_names/.var_names。

示例

# 1. 质控
adata.var['mt'] = adata.var_names.str.startswith('MT-')
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=['mt'], inplace=True)
sc.pl.violin(adata, ['n_genes_by_counts','total_counts','pct_counts_mt'],
             jitter=0.4, multi_panel=True)
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200)
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3)
adata = adata[adata.obs.pct_counts_mt < 5, :]
# 双胞检测（在原始计数、归一化前；1.10 起进核心 API）
sc.pp.scrublet(adata)
adata = adata[~adata.obs['predicted_doublet'], :].copy()

# 2. 归一化与预处理
sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)
sc.pp.log1p(adata)
adata.raw = adata                       # 先备份再过滤基因
sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=2000)
adata = adata[:, adata.var.highly_variable]
sc.pp.regress_out(adata, ['total_counts','pct_counts_mt'])
sc.pp.scale(adata, max_value=10)

# 3. 降维
sc.tl.pca(adata, svd_solver='arpack')
sc.pl.pca_variance_ratio(adata, log=True)   # 看肘部确定 n_pcs
sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=10, n_pcs=40)
sc.tl.umap(adata)

# 4. 聚类（Leiden 推荐；louvain 在 1.12 已弃用）
sc.tl.leiden(adata, resolution=0.5)
sc.pl.umap(adata, color='leiden', legend_loc='on data')
for res in [0.3, 0.5, 0.8, 1.0]:
    sc.tl.leiden(adata, resolution=res, key_added=f'leiden_{res}')

# 5. Marker（仅探索性）
sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', method='wilcoxon')
sc.pl.rank_genes_groups_dotplot(adata, n_genes=5)
markers = sc.get.rank_genes_groups_df(adata, group='0')

# 6. 细胞类型注释
marker_genes = ['CD3D','CD14','MS4A1','NKG7','FCGR3A']
sc.pl.dotplot(adata, var_names=marker_genes, groupby='leiden')
cluster_to_celltype = {'0':'CD4 T cells','1':'CD14+ Monocytes',
                       '2':'B cells','3':'CD8 T cells'}
adata.obs['cell_type'] = adata.obs['leiden'].map(cluster_to_celltype)

# 7. 保存
adata.write('results/processed_data.h5ad')
adata.obs.to_csv('results/cell_metadata.csv')

跨条件严谨 DE 用 pseudobulk（再交给 pydeseq2）：

pb = sc.get.aggregate(adata, by=['sample','cell_type'], func='sum', layer='counts')

轨迹推断（PAGA + 扩散拟时）：

sc.tl.paga(adata, groups='leiden'); sc.pl.paga(adata, color='leiden')
adata.uns['iroot'] = np.flatnonzero(adata.obs['leiden']=='0')[0]
sc.tl.dpt(adata); sc.pl.umap(adata, color='dpt_pseudotime')

注意事项

• 先备份原始计数：过滤基因前执行 adata.raw = adata；画基因表达图用 use_raw=True 显示 .raw 中归一化值。
• 认真看 QC 图：阈值随数据质量调整。常用经验值——min_genes 200500，min_cells 310，pct_counts_mt 5%~20%。
• 聚类用 Leiden，sc.tl.louvain 在 1.12 已弃用；多试几个 resolution（0.4~1.2，越大簇越多）。
• 关键超参：target_sum（默认 1e4）、n_top_genes（20003000）、n_pcs（看 variance ratio 肘部）、n_neighbors（1030）。
• DE 不要误用：rank_genes_groups p 值仅供探索，跨条件请 pseudobulk + pydeseq2。
• 存图用 settings：sc.settings.autosave + figdir，逐图 save= 已弃用；发表图设 dpi=300, frameon=False，file_format_figs='pdf'。
• 存检查点：长流程易中途失败，关键步骤写中间结果；多用多个 marker 验证注释。
• 版本要求：Python 3.12+（1.12 已弃 ≤3.11），anndata ≥0.10。

互见

• rag-pipeline-builder：当需要把分析结论/文献检索接入检索增强流程时
• csv-data-cleaner：导出的 cell_metadata.csv / gene_metadata.csv 后续清洗时

本条采编自 K-Dense-AI/scientific-agent-skills（MIT），适配重写而非逐字翻译。